| Cat. No. |
P06021 250U |
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P06022 1000U |
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| 产品说明 |
Pfu DNA 聚合酶是一种高保真性的耐高温DNA 聚合酶。在模板及引物存在的条件下，Pfu催化沿5’- 3’方向DNA的合成。同时本酶还具有3’ - 5’外切核酸酶活性（高保真），能纠正DNA扩增（PCR）过程中产生的错误。Pfu是目前已发现的在所有耐高温DNA聚合酶中PCR反应时出错率最低的一种。它比Taq DNA Polymerase及其变体低10倍。Pfu的超常纠错特性是由该酶本身的性质决定的。其它高温DNA聚合酶与Pfu混合使用，可以部分降低产品的错误率，但是效果达不到单独使用Pfu的高保真率。Pfu被公认为是您首选的高保真性耐高温DNA聚合酶。 |
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| 来 源 |
由Pyrococcus furiosus Pfu 的基因经过克隆转化到大肠杆菌中进行表达后，分离提取得到。 |
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| 应 用 |
常规PCR
基因的高保真扩增，克隆和表达
基因的定点突变
细胞内基因突变分析
末端补平
DNA的序测 |
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| 贮存条件 |
-20℃保存贮存。 |
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| 反应条件 |
在 10× Buffer 中加入DNTPs、引物、模板及DNA酶，添加水补充体系。 |
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| 10×Buffer |
200mM Tris-HCl (pH 8.8，25℃), 100mM KCl, 160mM (NH4)2SO4, 20mM MgSO4, 1.0% TritonX-100和1mg/ml BSA。 |
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| 单位定义 |
在75℃条件下，30分钟内催化10nmol dNTP的掺入反应成为酸不溶性物质所需的酶量为一个单位。 |
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| 分 子 量 |
92,000 dltons |
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| 质量控制 |
本品经过PCR验证，活性测定，内切核酸酶/缺刻酶测定和SDS-PAGE纯度鉴定。保证产品的质量稳定可靠。 |
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| 酶的特性 |
PCR产物为平端 , 无3’端的单个dA
3’－5’外切核酸酶活性（高保真）
无5’-3’ 外切核酸酶活性
DNA聚合时的延伸速度约为每分钟600碱基
最佳温度65-75度
dNTP工作浓度为100-300mM, 最佳Mg2+浓度为 2-3 mM, 最佳pH为8.1-9.1 |
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| 应 用 例 |
注意：以下举列为常规PCR反应系统，仅供参考。实际反应条件因模板、引物等的结构不同而各异，需根据模板、目的片段的大小、碱基序列和引物长短等具体情况，设定最佳反应条件。
以lambda DNA为模板，扩增1kb的片段
1、PCR反应体系的建立，50ul反应体系如下（可根据比例放大或缩小体系）：
Template <1ug
Primer1(10pM/ul) 0.5ul
Primer2(10pM/ul) 0.5ul
10×Pfu Buffer 5ul
dNTP Mixture(10mM) 1ul
Pfu(5U/ul) 0.5ul
ddH2O 补至50ul体系
2、PCR反应循环的设置：
95℃ 5min;94℃ 30s,62℃ 40s,72℃ 1min, for 25 cycles;72℃ 7min
3、结果检测：反应结束后，取4ul PCR反应产物，琼脂糖凝胶电泳检测。 |
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| 注意事项 |
1. Pfu扩增效率通常比Taq酶差，这是由于Pfu具有3’-5’的外切酶活性（高保真性）所引起的，而不是由于Pfu酶的质量不稳定所致。所以应根据扩增产物的长度设置相应的延伸时间，一般情况下pfu的延伸速度为每分钟0.5-1kb 。Pfu扩增1.5kb以下的DNA片段和Taq没有多大差别。
2.提高反应体系的pH和Mg2+浓度能部分提高DNA扩增的产率，但产物的保真性将有所下降。不提倡用Taq PCR反应缓冲液代替Pfu缓冲液做高保真性扩增。 |
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